بررسی سمیت غلظتهاي تحت کشنده نیترات نقره بر برخی شاخص هاي هماتولوژي و ایمونولوژي ماهی قرمز
(Carassius auratus)

صفورا ابرقویی،*
Sabarghoei67@gmail.com سید علی اکبر هدایتی رسول قربانی حامد کلنگی میاندره طاهره باقري

چکیده زمینه و هدف
در میان آلایندههاي فلزي، یون نقره بسیار سمی است و بالاترین درجه سمیت را در رده بندي مواد سمی به خود اختصاص داده است. امروزه ترکیبات نقره به دلیل خواص ضد میکروبی در صنایع مختلف استفاده میگردند. اما اثرات غیرقابل بازگشت فلزات سنگین غیرضروري همانند نقره، در بدن آبزیان غیر قابل بازگشت میباشد. در مطالعه حاضر به بررسی اثرات تحت کشنده نیترات نقره بر پارامترهاي خون شناسی و ایمنی شناسی ماهی قرمز (Carassius auratus) به عنوان گونه مدل کپور ماهیان پرداخته شد.
روش بررسی
تعداد 105 قطعه ماهی قرمز، به صورت تصادفی در 15 مخزن فایبرگلاس (400 لیتري) قرار گرفتند( 12 مخزن براي غلظتهاي مختلف نیترات نقره و 3 مخزن به عنوان گروه شاهد) و براي آزمونهاي بیوشیمیایی وخون شناسی تیمارها، 9 ماهی به طور تصادفی از هر تیمار انتخاب شد که به طور جداگانه در معرض غلظتهاي موثر ppm 01/0، 025/0، 05/0 و 1/0نیترات نقره قرارگرفتند. شاخصهاي مورد اندازهگیري شامل تعداد کل گلبولهاي سفید (لوکوسیت)، لنفوسیت، نوتروفیل، ائوزینوفیل، تعداد کل گلبولهاي قرمز (اریتروسیت)، محتواي هموگلوبین، سطح هماتوکریت، حجم متوسط گلبولی( MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی( MCH)، درصد غلظت هموگلوبین داخل گلوبولی و گلوکز سرم بود.
یافته ها
نتایج آزمایش نشان داد که غلظتهاي مختلف نیترات نقره بر روي عوامل اریتروسیتی خون ماهی قرمز در سطح 5/0 معنی دار بود (کاهش معنی دار) ، اما بر روي اغلب عوامل لوکوسیتی خون تاثیر چندانی نداشت.
نتیجه گیري
این امر ممکن است به دلیل مقاوم بودن این ماهی نسبت به ماهیان دیگر باشد و در نهایت شاخصهاي اریتروسیتی خون میتوانند به عنوان بیومارکرهاي مناسب آلودگی نقره معرفی گردند.

واژه هاي کلیدي: آلودگی، ماهی قرمز، خونشناسی، نیترات نقره، سم شناسی

مقدمه
میزان نقره در پوسته زمین در حدود 1/0 گرم در هر تن میباشد (1). در میان آلاینده هاي فلزي، یون نقره بسیار سمی است و بالاترین درجه سمیت را در رده بندي مواد سمی به خود اختصاص داده است . سمی بودن آن براي طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها و همچنین سمیت کم آن براي انسان منجر به توسعه تعداد زیادي از محصولات بر پایه نقره شده است(2). اثر باکتریایی یون نقره بر روي بسیاري از موارد مورد مطالعه قرار گرفته است( 3). یون نقره به طور گسترده در مراقبتهاي بهداشتی براي کنترل میکروارگانیسمها به ویژه در سیستم تأمین آب مورد استفاده قرار میگیرد و به دلیل اینکه هیچ گونه تاثیر نامطلوب بر رنگ، بو و طعم آب ندارد بسیار مورد توجه است( 4).
نقره عمدتاً، بهدلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژهاي که از خود نشان میدهد در مصارف الکترونیکی، نوري، دارویی و بهداشتی کاربرد فراوان دارد (5) نیترات نقره به عنوان عامل ایجاد کننده گروه هاي فعال اکسیژنی (ROS) شناخته شده و به وسیله مکانیسمهاي متنوع، شامل بر هم کنش با گروههاي سولفیدریل پروتیینها و آنزیمها به سلول آسیب میرساند. در حالی که بخش وسیعی از نقره در آبهاي سطحی به صورت طبیعی وارد میگردد، فعالیتهاي بشري از قبیل معدن، ساخت جواهرات و عکاسی میتوانند سطوح نقره را در آبهاي محیطی افزایش دهند (1). تعدادي از مطالعات نشان دادند که نیترات نقره به شدت براي ماهیان آب شیرین سمی است( 6).
سیستمهاي آبی، پیوسته با مشکلات ناشی از آلایندههایی مواجه هستند که از منابع مختلف مانند فاضلابهاي صنعتی، پسابهاي کشاورزي و فاضلابهاي شهري وارد آنها میشوند. آلایندهها (فلزات سنگین، سموم و فرآوردههاي نفتی) براي سیستم زیستی محیطهاي آبی زیان آور بوده و عمدتا بدون هیچ تصفیهاي به آبها وارد میگردند (7). اکوسیستم آبی در پایینترین سطح از ارتفاع قرار دارد، در نتیجه مقصد نهایی تمام آلایندههاي محیطی آب است. در نتیجه آلوده شدن آب با این مواد و نهایتا با تغذیه از آبزیان در طول زنجیره غذایی به انسان منتقل شده و در طول زمان در بدن موجودات و انسان انباشته میشود. وجود آنها در بدن خطرات جبران ناپذیري را در سالهاي طولانی به دنبال دارد (2).
در محیطهاي آبی، ماهی به عنوان یک آبزي براي ارزیابی اثر آلایندههاي محیطی در بوم سامانههاي آبی در نظر گرفته میشود. ماهی در بالاترین نقطه زنجیره غذایی آبی قرار گرفته است و توانایی بزرگ نمایی زیستی فلزات سنگین، حتی در غلظتهاي پایین موجود در محیط را دارد( 8). ماهی قرمز از خانواده کپور ماهیان میباشد و از لحاظ شرایط زیستی و تغذیهاي شبیه کپور معمولی است. این ماهی در ایران در حوضههاي دریاي خزر، دریاچه ارومیه و هامون در سیستان و رودخانه کارون پراکنش یافته است. این گونه جهت مطالعات تولید مثلی، سلولی مولکولی، ایمنی شناسی، سم شناسی بسیار مناسب میباشد، زیرا از اندازه مناسبی جهت تحقیقات آزمایشگاهی برخوردار است و همچنین در محیطهاي آزمایشگاهی به راحتی قادر به بلوغ و تولیدمثل میباشد. در واقع از این گونه به عنوان مدل جهت بررسی کپورماهیان استفاده میگردد (9).
خون شاخص مهمی براي وضعیت فیزیولوژیک اندامهاي بدن در تشخیص سلامت یا بیماري و کنترل روند زیستی موجودات زنده ازجمله ماهی میباشد( 10). مطالعات خون شناسی روش ارزشمندي براي ارزیابی آثار محیطی آلایندهها روي ماهیان می باشد( 11). شاخصهاي مربوط به خون مانند گلبولهاي قرمز و گلبولهاي سفید از جمله لنفوسیتها، نوتروفیلها و مونوسیتها یکی از بخشهاي سیستم ایمنی غیر اختصاصی سلولی هستند که نوسان در تعداد آنها میتواند به عنوان یک شاخص مناسب در ارتباط با پاسخ ماهیان به عوامل استرس مطرح باشد( 12).
با توجه به استفادههاي روزافزون ترکیبات نقره به دلیل خواص آنتی باکتریال در صنایع مختلف و اثرات غیرقابل بازگشت فلزات سنگین غیر ضروري همانند نقره در بدن آبزیان و نیز با توجه به این که مطالعات اندکی در رابطه با سمیت نیترات نقره وجود دارد، هدف از مطالعه حاضر افزایش اطلاعات در این زمینه و ارزیابی خطر این ماده براي محیط زیست میباشد. در تحقیق حاضر جهت بررسی
اثرات تحت کشنده نمک نیترات نقره بر شاخصهاي خونشناسی و ایمنیشناسی، ماهی قرمز به عنوان گونه مدل در بررسی خانواده کپور ماهیان انتخاب شد تا از این طریق مارکر خونی مناسبی براي سمیت نیترات نقره مشخص شود.
روش بررسی
در پاییز سال 1392 تعداد 105 n=قطعه ماهی قرمز، از مرکز فنی حرفه اي آق قلا، با میانگین وزنی 05/12 ±33/56 گرم تهیه و به مرکز تحقیقات آبزي پروري دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان منتقل شد. ماهیها براي انجام آزمایش به صورت تصادفی در 15 مخزن فایبرگلاس (400 لیتري) قرار گرفتند (12 مخزن براي غلظتهاي مختلف نیترات نقره و3 مخزن به عنوان گروه شاهد) و براي سازگاري به مدت 2 هفته در شرایط آزمایشگاهی نگهداري و با غذاي تجاري رایج در بازار، به میزان 2 درصد وزن بدن غذادهی شدند. در دوره سازگاري و آزمایش، آب هوادهی و کلرزدایی شد و مشخصات فیزیکوشیمیایی آب به طور روزانه اندازهگیري گردید. در طول دوره سازگاري و آزمایش ماهیان تحت رژیم نورانی 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی قرار گرفتند. نیترات نقره مورد استفاده از محصولات Merck آلمان در غلظت ppm5000 در ظرف شیشه اي در بسته تهیه شد.
جهت بررسی اثرات نیترات نقره بر پارامترهاي خونی ماهی قرمز، ماهیان تحت تاثیر 4 غلظت مختلف از محلولنیترات نقره قرار گرفتند و یک گروه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. انتخاب غلظتها، با توجه به مدت زمان آزمایش و پس از تعیین 50LC (سمیت کشندگی حاد) صورت گرفت. نیترات نقره مورد استفاده در مدت 96 ساعت، ppm 184/ اندازهگیري شد. غلظتهاي موثر نیترات نقره به ترتیب ppm 01/0، 025/0، 05/0 و 1/0 بودند و مدت زمان آزمایش دو هفته بود. هر غلظت ذکر شده به یک مخزن 50 لیتري اضافه شد و پیش از انجام آزمایش آب به مدت 2 دقیقه به شدت هوادهی گردید. (در هر تیمار 21 قطعه ماهی و براي هر تیمار 3 تکرار 7 تایی در نظر گرفته شد). آزمایش به طور پویا انجام شد و شرایط فیزیکو شیمیایی آب به طور روزانه کنترل گردید. غذادهی در حد سیري و تعویض آب به صورت یک روز در میان با سیفون کردن از کف به اندازه 50 درصد حجم آب انجام شد. هیچ گونه مرگ و میري در طول آزمایش مشاهده نشد و پس از پایان دوره آزمایش، ماهیان به منظور خونگیري با پودر گل میخک به اندازه 2 گرم در لیتر بیهوش شدند. به دلیل تغییر فعالیت متابولیسمی با تغییر اندازه ماهی و تأتیر بر پارامترهاي بیوشیمیایی خون، سعی شد از ماهی با طول نسبتا مشابه استفاده شود (13).
براي آزمایشهاي خون شناسی تیمارها و نمونه شاهد، 9 ماهی به طور تصادفی از هر تیمار انتخاب شد که به طور جداگانه در معرض غلظت هاي موثر نیترات نقره قرارگرفته بودند. نمونه شاهد در معرض هیچ غلظتی از نیترات نقره قرار نگرفت. وقتی ماهیان به مرحله بیهوشی عمیق رسیدند، سطح بدن خشک و سپس خونگیري با قطع ورید ساقه دمی انجام شد. به دلیل اینکه خون ماهیان در معرض غلظتها به شدت غلیظ شده بود امکان خونگیري از طریق سرنگ وجود نداشت. نمونههاي خون در لولههاي حاويEDTA به عنوان ماده ضد انعقاد قرار گرفتند. شاخصهاي مورد اندازهگیري شامل تعداد کل گلبولهاي سفید (لوکوسیت)، لنفوسیت، نوتروفیل، ائوزینوفیل، تعداد کل گلبولهاي قرمز (اریتروسیت)، محتواي هموگلوبین، سطح هماتوکریت، حجم متوسط گلبولی (MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی (MCH) و درصد غلظت هموگلوبین داخل گلبولی بود (14). شمارش گلبولهاي سفید وگلبولهاي قرمز به روش هموسیتومتري انجام گرفت (15). مقدار هماتوکریت و غلظت هموگلوبین نیز به روش میکروهماتوکریت و سیانومت هموگلوبین سنجش گردید. به منظور شمارش افتراقی گلبولهاي سفید، گسترش خونی بر روي لام تهیه و گسترشهاي تثبیت شده با استفاده از رنگ گیمسا رنگ آمیزي شدند.
براي اندازه گیري گلوکز ، گلبولهاي قرمز در لوله قرار داده شد و به مدت 30 دقیقه در دماي اتاق (22 درجه سانتیگراد) فرصت داده شد تا لخته شود. سرم از لخته جدا شد و نمونه پس از سانتریفیوژ در مدت زمان 5 دقیقه در دماي 80- درجه سانتیگراد منجمد شد تا زمانی که آنالیزها روي آن انجام شود. گلوکز خون به وسیله روش اسپکتوفتومتري (WPAS2000-UV/VIS کمبریج انگلستان)، و با استفاده از کیت پارس آزمون اندازهگیري شد. اطلاعات حاصل از هر آزمایش با استفاده از نرم افزارSPSS 20 و با انجام آزمون ANOVA یک طرفه و تست توکی در سطح معناداري 5 درصد (05/0<P) مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفت. همه نتایج به دست آمده به وسیله میانگین ± انحراف معیار محاسبه شدند.

یافتهها
طبق بررسی نتایج آماري هیچ گونه اختلاف معنیدار، در وزن کل و طول کل ماهیان تیمارهاي مختلف با گروه شاهد مشاهده نشد (جدول1) (05/0p>). از آنجایی که سعی بر آن بود ماهیان با طول و وزن تقریبی یکسان انتخاب گردند، عدم وجود اختلاف معنی داري در شاخصهاي رشد سوماتیک قابل پیش بینی بود. فاکتورهاي فیزیکو شیمیایی آب به طور روزانه اندازهگیري شد و مشخصات فیزیکو شیمیایی به صورت زیر بود: دما= 1 ± 5/19 سانتیگراد، اکسیژن محلول= 06/. ± 80/8 میلی گرم در لیتر، پی اچ= 45/. ± 56/7، سختی کل= 35/2 ± 293 میلی گرم در لیتر، آب به صورت روزانه تعویض و پارامترهاي کیفی آب دوبار در هفته اندازهگیري شد (دستگاه اندازهگیري پی اچ، دما و اکسیژن متر و فتومتر 7100 انگلستان.)
جدول(1)- نتایج زیست سنجی ماهی قرمز در مواجهه با غلظتهاي تحت کشنده نیترات نقره
Table (1) – The Result of the biometrics of fishes exposed to sub-lethal concentrations of silver nitrate

غلظت 5(ppm) غلظت1(ppm) غلظت 5/0(ppm) غلظت 1/0(ppm) گروه شاهد زیست سنجی ماهیان
14/83±0/28a 13/83±1/60a 14/67±2/75a 15/00±1/32a 16/33±0/57a طول کل (سانتی
41/00±5/29a 45/33±12/89a 44/67±16/16a 54/33±13/31a 61/66±14/57a متر) وزن کل (گرم)
*دادهها به وسیله میانگین± انحراف معیار محاسبه شدند. مقادیر به دست آمده براي هر ویژگی که حداقل داراي یک حرف مشترك میباشند ،از نظر آماري در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار ندارند.

اثر غلظتهاي مختلف نیترات نقره بر عوامل خونی ماهی قرمز در جدول(2) ارایه شده است. تعداد گلبولهاي قرمز گروه شاهد نسبت به غلظت-هاي مختلف نیترات نقره، کاهش معنی دار داشت( 05/0<p). همچنین میزان هماتوکریت، کاهش پیدا کرد و بین گروه شاهد با سایر تیمار ها اختلاف معنیدار وجود داشت( 05/0<p). هموگلوبین خون گروه شاهد با سایر غلظتها اختلاف معنیدار داشت و با افزایش غلظت محلول نیترات نقره، کاهش معنی دار پیدا کرد( 05/0<p). گلوگز خون روند افزایشی داشت و بین گروه شاهد با غلظت 05/0 اختلاف معنی دار وجود داشت( 05/0<p) و در این غلظت به بیشترین مقدار رسید، اما نسبت به سایر غلظتها افزایش معنیدار نداشت( 05/0p>). تعداد گلبولهاي سفید گروه شاهد با سایر غلظتها اختلاف معنیدار نداشت( 05/0>p) اما در بیشترین غلظتها( 05/0 و 1/0) بیشترین افزایش را نشان داد.
M.C.H.C خون گروه شاهد نسبت به سایر غلظتها کاهش یافت( 05/0<M.C.V (.p گروه شاهد، نسبت به سایر غلظتها، افزایش یافت
(05/0<p)، اما بین غلظتهاي مختلف نسبت به هم اختلاف معناداري وجود نداشت( 05/0>p). افزایش M.C.H گروه شاهد نسبت به سایر غلظتها به طور معنیدار نبود (05/0>p). نوتروفیل گروه شاهد فقط در اولین غلظت اختلاف معنی دار داشت اما میزان آن با سایر غلظتها اختلافی نداشت( 05/0>p). ائوزینوفیل گروه شاهد با سایر غلظتها اختلاف معنی دار نداشت( 05/0>p). میزان لنفوسیت گروه شاهد نسبت به غلظتهاي 01/0 و 025/0 افزایش معنی دار داشت( 05/0<p) و در دو غلظت 05/0 و1/0 کاهش پیدا کرد که این میزان کاهش فقط با غلظت 1/0 معنی دار بود( 05/0<p) .
جدول (2)- میزان پارامترهاي خونی ماهی کاراس طلایی در مواجه با غلظتهاي تحت کشنده نیترات نقره
Table (2)_ The amount of of blood parameters of gold fish exposed to sub-lethal concentrations of silver
nitrate
غلظت 1/0
(قسمت در میلیون) غلظت05/0
(قسمت در میلیون) غلظت 025/0 (قسمت در میلیون) غلظت 01/0 (قسمت در میلیون) گروه شاهد عوامل اندازهگیري شده
0/97±0/01 b 0/97±0/00 b 0/97±0/00 b 0/96±0/02b 1/15±0/05a گلبول قرمز

(106× میکرو لیتر)
21/33±0/15d 21/47±0/05cd 21/73±0/05bc 22/03±0/05b 22/83±0/25a هماتوکریت (درصد)
6/33±0/15d 6/47±0/05d 6/73±0/05c 7/03±0/05b 7/57±0/11a هموگلوبین
(گرم بر دسیلیتر)
354/33±74/19ab 410/67±61a 271/73±54/93ab 252/00±49/93b 220/67±10/01b گلوکز
(میلیگرم بر دسیلیتر)
29/67±0/50d 30/10±0/17 d 31/00±0/17c 31/90±0/17b 32/23±0/05a M.C.H.C
(گرم بر دسی لیتر)
221/54±2/97a 221/24±0/56a 224/57±3/99a 221/51±0/32a 199/36±7/54b M.C.V
(فمتو لیتر)
62/69±1/34b 63/03±4/26 b 69/63±1/03a 70/71±0/491a 66/03±2/14 ab M.C.H
(پیکو گرم)
71000/00±1732/15a 66666/67± 1527/52a 44733/33±
33385/52a 62666±2516/a 65666/66± 1154/70a گلبول سفید (103× میکرو لیتر)
89/67±0/57 c 91/67±0/57 b
95/00±1/00a 94/67±0/57a 92±0/00 b لنفوسیت (درصد)
41/67±0/57a 1/67±0/57a 2/33±0/57a 1/67±0/57a a0/33±0/57 ائوزینوفیل (درصد)

*دادهها به وسیله میانگین± انحراف معیار محاسبه شدند. مقادیر به دست آمده براي هر ویژگی که حداقل داراي یک حرف مشترك میباشند ،از نظر آماري در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار ندارند.

بحث و نتیجه گیري
نقره یونی، براي موجودات زنده بسیار سمی است (16)، هر چند ممکن است اشکال دیگري از نقره وجود داشته باشد که فقط در دسترس موجودات زنده است (17). خاصیت ضد میکروبی آنتی باکتریال این ماده، منجر به گسترش تعداد زیادي از محصولات بر پایه نقره شده است.
نقره فلزي است که به دلیل کاربرد فراوان در اشکال مختلف نمک و نانو نقره، به طور گسترده اي در محیط پراکنده شده است. اما در منابع اطلاعاتی موجود، اطلاعات محدودي در رابطه با سمیت نیترات نقره وجود دارد (18).
در مطالعه صورت گرفته روي جامعه پلانکتونی (2) غلظت مورد استفاده نقره، 5 میکروگرم بر لیتر به صورت 3AgNO بود و غلظت هاي بالاتر از این مقدار موجب تغییر جامعه پلانکتونی شدند. همچنین همه موجودات یوکاریوتی، پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض 100 میکروگرم بر لیتر نقره از محلول 3AgNO از بین رفتند. حتی در غلظت 10 میکروگرم بر لیتر نقره از محلول 3AgNO در مدت یک روز تاژکداران و داینوفلاژله هاي کمتري نسبت به گروه شاهد زنده ماندند (19) که این امر نشان دهنده سمیت بالاي این ماده در موجودات زنده است و با مطالعه ژائو و وانگ (4) درسال 2011 همخوانی دارد که بیان میکنند غلظت 50LC براي نیترات نقره، مقدار بسیار کمی یعنی (51/2) میکرو گرم بر لیتر میباشد.
در مطالعه دیگري بر روي سمیت یون نقره که توسط ناوارو و همکاران در سال 2008 انجام گردید (20)، گزارش شد که انتشار یون نقره در جلبک سبز کلامیدوموناس (Chlamydomonas reinhardtii) موجب مهار فتوسنتز خواهد شد. اما در هیچ کدام از مطالعات انجام شده سمیت یون نقره در سطح سلولی بررسی نشده است. محیط زیست ماهیان و شرایط حاکم بر آن (نظیر آلودگی) بر مقادیر سلولهاي خونی و سایر عوامل خونی تاثیر میگذارد که این تغییرات میتواند به عنوان شاخص زیستی مد نظر قرار گیرد. با توجه به اینکه پارامترهاي خونی شرایط نامطلوب محیطی را براي ماهیان سریعتر از پارامترهاي دیگر نشان میدهند، تا حد زیادي براي تعیین وضعیت سلامت و نظارت بر پاسخهاي استرسی ماهیان براي پیش بینی سازگاريهاي فیزیولوژیکی آنها استفاده میشود (11). زیست آزمونی (Bioassay) روشی است که عکس العملهاي موجودات آبزي براي آشکارسازي، اندازهگیري یا تأثیر یک یا چند ماده سمی یا عامل محیطی به تنهایی یا توأم با یک دیگر را مورد بررسی قرار میدهد( 21). با استفاده از در معرض قرار دادن ارگانیسمها درغلظتهاي مختلف موادآلوده کننده، زیست آزمونی براي ارزیابی اثرات سمیت آنها انجام میگیرد که به وسیله پایش خصوصیات و رفتارهاي بیولوژیک این ارگانیسمها و مقایسه آن با ارگانیسمهایی که هیچ گونه مواجهاي با مواد آلوده کننده نداشته اند امکان پذیر میباشد (22). در زیست آزمونی از موجودات گوناگونی نظیر جلبک، ماهی ،باکتري و انواع موجودات آب شیرین نظیر دافنی استفاده میشود (14). بر این اساس ماهی براي ارزیابی خطر سمیت نیترات نقره انتخاب گردید .

در مطالعه حاضر، تعداد گلبولهاي قرمز گروه شاهد، کاهش معنی داري با تمام غلظتهاي مختلف نیترات نقره داشت( 05/0<p). همچنین میزان هماتوکریت، M.C.H.C و هموگلوبین خون کاهش پیدا کرد و بین گروه شاهد با سایر تیمار ها اختلاف معنیدار دیده شد (05/0<p).
تحت شرایط استرس زا گلبولهاي قرمز نابالغ از طحال آزاد شده و با افزایش متابولیک، اکسیژن رسانی به ارگانهاي مهم افزایش مییابد که به دنبال آن گلبولهاي قرمز، غلظت هموگلوبین و سطح هماتوکریت افزایش مییابد( 24 و 23). کاسیلاس و همکاران( 25) در تحقیقی اثرات استرس بر ماهی قزل آلاي رنگین کمان را مطالعه کرده و بیان نمودند که استرس به هر دلیلی سبب افزایش هموگلوبین، هماتوکریت و تعداد گلبول هاي قرمز میشود. در پاسخ به استرسهاي موجود در محیط آبی، کاهش تعداد گلبولهاي سفید میتواند بیانگر سرکوب ایمنی موجود و افزایش میزان آنها نشان دهنده پاسخ به استرس یا عفونت باشد( 26). در مطالعه حاضر غلظت گلوکز روند افزایش داشت، هرچند که این افزایش در همه غلظتها معنی دار نبود و فقط بین گروه شاهد با غلظت 05/0 اختلاف معنی دار وجود داشت( 05/0p<). بنابراین میتوان نتیجه گرفت غلظتهاي تحت کشنده نیترات نقره عامل ایجاد استرس در ماهی قرمز نیستند .
کاهش شاخصهاي اریتروسیتی خون به دلیل کمخونی رخ میدهد. در طی کم خونی، کاهش تعداد گلبولهاي قرمز، هموگلوبین و هماتوکریت مشاهده میشود که ممکن است به دلیل خونریزي، همولیز یا کاهش تولید گلبولهاي قرمز صورت پذیرد که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد( 27). شاخصهاي لوکوسیتی خون شامل گلبولهاي سفید از جمله لنفوسیتها، نوتروفیلها و مونوسیتها یکی از بخشهاي سیستم ایمنی غیر اختصاصی سلولی هستند که نوسان در تعداد آنها میتواند به عنوان یک شاخص مناسب در ارتباط با پاسخ ماهیان به عوامل استرس مطرح باشد (24). در پاسخ به استرسهاي موجود در محیط آبی، کاهش تعداد گلبولهاي سفید میتواند بیانگر سرکوب ایمنی موجود و افزایش میزان آنها نشان دهنده پاسخ به استرس یا عفونت باشد (26). در مطالعه حاضر به جز لنفوسیت بین شاخصهاي لوکوسیتی خون ماهی شاهد و سایر غلظتها اختلاف معنیدار وجود نداشت. در این آزمایش ابتدا لنفوسیت در دو غلظت افزایش و سپس کاهش پیدا کرد (05/0<p). لنفوسیتها نسبت به سایر لکوسیتها طول عمر زیادتري دارند و اغلب در مواجهه باآلودگی کاهش پیدا میکنند. در تحریک یا سرکوب سیستم ایمنی، لنفوسیتها بیومارکرهاي کارآمدي محسوب میشوند( 27) اما در تعداد گلبولهاي سفید در بالاترین غلظتها( 05/0 و 1/0) افزایش مشاهده شد، هرچند این تغییرات معنیدار نبود اما با مطالعات زارچی (28) مطابقت دارد که بیان میکند بدن، جهت مقابله با نانو ذرات نقره ورودي تولید گلبولهاي سفید را افزایشمیدهد. از آنجایی که افزایش غلظت نیترات نقره، میتواند موجب تغییر در تعداد گلبول هاي سفید شود با افزایش غلظت از 01/0 تا 025/0ppm گلبولهاي سفید کاهش پیدا کرد که با مطالعات چن و همکاران(29) مطابقت دارد که بیان میکنند افزایش درگیري سلولها در فرآیند ایمنی، موجب کاهش سلولهاي خونی میگردد .
به طور کلی نتایج آزمایش حاصل نشان داد که غلظتهاي مختلف نیترات نقره بر روي عوامل اریتروسیتی خون ماهی قرمز تاثیر گذار بود (05/0<p)؛ اما بر روي عوامل لوکوسیتی خون تاثیر چندانی نداشت که این امر ممکن است به دلیل مقاوم بودن این ماهی نسبت به ماهیان دیگر باشد علاوه بر این چون یون نقره به تنهایی خاصیت آنتی باکتریال دارد ،عدم تاثیر بر اکثر عوامل لوکوسیتی تایید کننده این مطلب است که یون نقره سبب افزایش ایمنی سلولی خواهد شد.
در مجموع با بررسی نتایج آنالیزهاي آماري مشخص شد که ماهی کاراس طلایی در مواجهه با غلظتهاي مختلف نیترات نقره، در بیشتر شاخصهاي اریتروسیتی خون تغییرات معنی دار داشت (05/0<p)، بنابراین این شاخصهاي اریتروسیتی خون میتوانند به عنوان بیومارکرهاي مناسب آلودگی نقره معرفی گردند.

تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت هاي مادي و معنوي دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی گرگان در قالب پایان نامه کارشناسی ارشد صورت گرفت .

Evaluation of sub lethal concentration toxicity of silver nitrate (AgNO3) on
some of hematology and immunology indices in goldfish (Carassius auratus)

Safoura Abarghouei (Corresponding Author)
Sabarghoei67@gmail.com
Seyed Ali Akbar Hedayati
Rasoul Ghorbani Hamed Kolangi Miyandareh
Tahereh Bagheri
Absteac
Introduction
Among metal pollutants silver ions are one of the most toxic forms, and have thus been assigned to the highest toxicity class. Today, due to the antibacterial properties of silver compounds are used in various industries. The effects of non-essential heavy metals such as silver are irreversible in aquatic animal body. In the present study, the sub lethal effects of silver nitrate on hematology and Immunology parameters of goldfish (Carassius auratus) as a model species in the family Cyprinidae were investigated.
Method
105 Fishe wererandomly assigned to in 15 fiberglass tanks .( Per tanks 400 liters) ¬ 12 tank for Different concentrations of silver nitrate and 3 tank for control groups. The fishes of each treatment were separately exposed to effective concentrations of silver nitrate 0.01, 0.025, 0.05 and 0.1 ppm and for hematological and biochemical test, nine fish were randomly selected from each treatment. Measured indices were total number of white blood cells (leukocytes), lymphocytes, neutrophils, eosinophil, total number of red blood cells (erythrocytes), hemoglobin content, hematocrit level, mean corpuscular volume (MCV), hemoglobin the corpuscular (MCH) and hemoglobin concentration and serum glucoses.
Results
The results showed that different concentrations of silver nitrate influenced (reduce) on blood erythrocyte (P<0.05) but did not affect on blood leukocyte.
Conclusion
These results may be due to the resistance of the gold fish compared to others and blood and blood erythrocyte indices can be used as a suitable biomarker of silver pollution.

Keywords: Pollution, Carassius auratus, Hematology, Silver nitrate, Toxicology

منابع
تربالی. باور و همکاران،1391، بررسی اثر نیترات نقره بر فعالیت آنزیم پرا کسیداز ترب کوهی، مجله علمی پژوهشی فیض، دانشگاه علوم پزشکی کاشان، صص 713-714.
Boenigk, J., Beisser, D., Zimmermann, S., Bock, C., Jakobi, J., Grabner, D., Sures, B., 2014. Effects of silver nitrate and silver nanoparticles on a planktonic community general trends after short-term exposure., PloS one, 9(4) ,pp. 95-340.
Chambers, C.W., Proctor, C.M., Kabler, P.W., 1962. Bactericidal effect of low concentrations of silver. American Water Works Association 54, 208–216.

Yahya, M.T., Straub, T.M., Gerba, C.P., 1992. Inactivation of coliphage MS-2 and poliovirus by copper, silver, and chlorine. Canadian Journal of Microbiology 38, 430–435.

Gong, P., Li, H., He, X., Wang, K., Hu, J., Tan, W., … & Yang, X. 2007. Preparation and antibacterial activity of Fe3O4@ Ag nanoparticles. Nanotechnology, 18(28), 285604.

Davies, P.H., Goettl, Jr., J.P. and Sinley, J.R., 1978. Toxicity of silver to rainbow trout (Salmo gairdneri). Water Res., 12: 113-117.

7.شاهسونی. داور، مهري. مهرداد و نظري .کوروش، 1382. بررسی تأثیر ماده شوینده آنیونی (شامپو) بر پارامترهاي خونی ماهی حوض
.پژوهش و سازندگی(Carassius auratus)

Bhagwant, S.and Bhikagee, M. 2000. Induction of hypochromic Macrocytic Anemiain Oreohromis hybrid (Cichlidae) exposed to 100mg/L (sub lethal dose) of Aluminum. Science and Technology- Research Journal .
Lee, L.E., Caldwell, S.J. and Gibbons, J. 1997. Development of a cell line from skin of goldfish (Carassius auratus), and effects of ascorbic acid on collagen deposition. Histochemistry and Cell Biology. 29: 31–43.

Mojabi, A. (2000). Veterinary clinical biochemistry. Noorbakhsh Press, Tehran, Iran, 477, 479. (In Persian).

Luskova, V., Halacka, K., & Lusk, S. 1995. Dynamics of the haemogram in the nase, Chondrostoma nasus. Folia Zoologica, 44, 69-74.

Stoskopf, M.A. 1993. Fish medicine. Sounders Company, U.S.A, 882p.

Cicik, B. and Engin, K. 2005. The effects of cadmium on levels of glucose in serum and glycogen reserves in the liver and muscle tissues of Cyprinus carpio(L.,1758). Turk J Vet Anim Sci. 29:113-117.

U.S.Environmental Protection Agency. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to fresh water and marine organisms [Online]. 2002; Available from: URL:
www,water.epa.gov/scitech/methods/cwa/wet/disk2_index.cfm/

Rabitto, I. S., Alves Costa, J. R. M., Silva de Assis, H. C., Pelletier, E., Akaishi, F. M., Anjos, A., … & Oliveira Ribeiro, C. A. (2005). Effects of dietary Pb (II) and tributyltin on neotropical fish, Hoplias malabaricus: histopathological and biochemical findings. Ecotoxicology and environmental safety, 60(2), 147-156.

Hogstrand C, Wood C.Toward a better understanding of the bioavailability, physiology, and toxicity of silver in fish: implications for water quality criteria. Environ Toxicol Chem 1998;17:547–61.

Campbell PGC, Errécalde O, Fortin C, Hiriart-Baer VP, Vigneault B.Metal bioavailability to phytoplankton —applicability of the biotic ligand model. Comparative biochemistry and physiology. Toxicol Pharmacol CBP CBP 2002;133:189–206
Mueller, N. C., & Nowack, B. (2008). Exposure modeling of engineered nanoparticles in the environment. Environmental Science & Technology, 42(12), 4447-4453.
Hund-Rinke, K., Marscheider-Weidemann, F., Kemper, M., & Simon, M. (2008). Beurteilung der Gesamtumweltexposition von Silberionen aus Biozid-Produkten.UBA Texte, 43(08).

20.Navarro E, Piccapietra F, Wagner B, Marconi F, Kaegi R, Odzak N, et al.Toxicity of silver nanoparticles toChlamydomonas reinhardtii. Environ Sci Technol 2008b;42:8959–64.

Martins J, Oliva TL, Vasconcelos V. Assays with
4495801863852

Daphnia magna and Danio rerio as alert systems in aquatic toxicology. Environ Int 2007; 33(3): 414-25

Nadafee K. Bioassay with micro organism, review article. J Shaheed Sadoughi Univ Med Sci 1995.

Molinero, A., & Gonzalez, J. 1995. Comparative effects of MS 222 and 2-phenoxyethanol on gilthead sea bream (Sparus aurata L.) during confinement. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 111(3), 405-414

Shaluei, F., Hedayati, A., Jahanbakhshi, A., & Baghfalaki, M. 2012. Physiological responses of great sturgeon (Huso huso) to different concentrations of 2-phenoxyethanol as an anesthetic. Fish physiology and biochemistry, 38(6), 1627-1634

25.Casillas, E., Smith, L.S.,1974. Effects of stress on blood coagulation and haematology in rianbow trout exposed to hypoxia, J.Fish Biol. 6, 379-380.
26.Adams, S. M. 2002. Biological indicators of aquatic ecosystem stress. American Fisheries Society.

27. هدایتی. سید علی اکبر ،جهانبخشی. عبدالرضا، قادري رمازي، فاطمه ،1392،سم شناسی آبزیان، انتشارات دانشگاه گرگان، چاپ اول، صص
.76-70
28.رضایی زارچی. س،1390، اثر نانو ذرات اکسیدتیتانیوم روي میزان سلولهاي خونی و آنزیمهاي کبدي در خون رت نژاد ویستار، مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، صص 626-618.

29.Chen, Z., Meng, H., Xing, G., Chen, C., Zhao, Y., Jia, G, Wan, L. 2006. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo. Toxicology letters, 163(2), 109-120.



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید